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第七章)第八章植物花药(花粉)培养汇总

  第八章 植物花药(花粉)培养与 单倍体育种 第八章 植物花药(花粉)培养与 单倍体育种 第一节 有关基本概念及含义 第二节 花药和小孢子的发育 第三节 花粉培养 第四节 花药培养 第五节 花药(花粉)培养中白化苗产生的 机理及影响因素 第六节 花药(花粉)培养及单倍体育种的 应用 第一节 有关基本概念及含义 1、植物花药与花粉(粒) 花药是植物花的雄性器官,由两部分细胞组成: (1)体细胞——药壁和药隔组织的细胞,按染色 体倍性,为二倍体细胞。 (2)雄性性细胞,即小孢子,又称“花粉粒”— —花粉粒的细胞,为单倍体细胞。 2、花药培养(Auther culture): 指把植物花药在合成培养基上进行培养,诱导 花粉(粒)再生植株的方法。属于一种器官(植物 雄性器官)培养。 第一节 有关基本概念及含义 3、花粉(粒)培养(Pollen culture): 指把花粉从花药中分离出来,以单个花粉 粒作为外植体进行离体培养的技术。属于单 细胞培养。 4、白化苗 指在花药(花粉)培养中,禾本科特别是 水稻因受有关因素影响,出现缺绿白化的再 生植株称之。 第一节 有关基本概念及含义 5、单倍体育种 指通过花药(花粉)培养诱导单倍体花 粉植株,经加倍纯合,快迅、准确地选育出 植物新品种的一种育种方法。 将具有单套染色体的单倍体植物,经人 工染色体加倍,使其成为纯合二倍体。从中 选出具有优良性状的个体。直接繁育成新品 种;或选出具有单一优良性状的个体,作为 杂交育种的原始材料,称之为单倍体育种。 第二节 花药和小孢子的发育 1.花药分化与花粉粒形成 花药是储存花粉粒的器官,1个花药里 可有成千上万个花粉粒。花药的分化程序 如图1所示: 在高等植物有性繁殖的世代交替生活史 中,花粉代表雄配子体世代,它通过小孢 子形成过程产生。 第二节 花药和小孢子的发育 2、母体内小孢子的正常发育 高等植物的小孢子母细胞发育至成熟的花 粉粒,整个发育程序大致可分为三个时期: 第一期是小孢子母细胞通过减数分裂形成 四分体;第二期为四分体分离开来,单个小 孢子继续发育;第三期是小孢子发育为成熟 的花粉粒。(图2) 第二节 花药和小孢子的发育 (以烟草花粉发育过程为例,说明被子植物花粉发 育过程,P222) 第一期:小孢子母细胞经减数分裂形成孢子四 分体,随胼胝质分解,4个小孢子分离。 第二期:小孢子为球形细胞,核大,有液泡, 挤核靠边(单核靠边期),期末细胞明显增大,细 胞壁特化,小孢子进行第一次花粉细胞有丝分裂 (不对称),形成2个不均等的细胞。 第三期:小孢子细胞中有2个核。 在离体培养条件下,花粉发育偏离正常发育途 径,第一次花粉细胞有丝分裂是对称的,结果形成 两个形态和体积相等的细胞,把此作为B型。 第二节 花药和小孢子的发育 3、离体培养的小孢子的发育途径 在离体培养的条件下,由于改变了小孢 子原来的生活环境,花粉的正常发育途径受 到抑制,出现不同的小孢子发育途径。对大 多数植物来说,离体培养条件下,诱导小孢 子雄核发育的最适时期是处于单核中、晚期 的花粉(花药)。(在四分体或双核期虽也 有成功报导,与后讲选材时期有关)。 第二节 花药和小孢子的发育 离体培养条件下,小孢子雄核发育主要有如下几条途 径:(图—3) (1)营养细胞发育途径(A途径): 即小孢子第一次有丝分裂,形成一个营养核和一个 生殖核,其生殖核较小,一般不分裂或分裂几次便逐渐 退化而败育,而较大的营养核不断分裂形成细胞团,并 迅速增殖成单倍性的愈伤组织或胚状体,最后形成单倍 体植株(图—3A)。 (2)生殖细胞发育途径(B途径) 在此途径中,营养核分裂1~2次即退化了,而生殖 核经多次分裂发育成多细胞团,进而通过形成单倍性的 愈伤组织或胚状体而产生单倍体植株。(图—3B) 第二节 花药和小孢子的发育 (3)营养细胞与生殖细胞并进的发育途径(C途径): 即小孢子中形成的生殖核和营养核同时分别持续分 裂,最后形成由营养核分裂而成的细胞较大的多细胞团 和由生殖核分裂而成的细胞较小的多细胞团所共同构成 的单倍性愈伤组织或胚状体(图—3C),最后也可产 生单倍体植株。 (4)小孢子均等分裂途径(D途径) 小孢子第一次分裂时为非正常的有丝分裂,即进行 均等分裂形成二个均等的子核,以后二核间产生细胞壁 而形成两个大小一致的子细胞,分别分裂而成多细胞团, 进而发育成单倍性的愈伤组织或胚状体而产生单倍体植 物(图—3D),此种途径较普遍。 第二节 花药和小孢子的发育 (5)小孢子内均等核融合途径(E途径): 即小孢子第一次异常有丝分裂产生的两个均等 的子核间不形成细胞壁,因而它们可相互融合,使 核二倍化,最后形成纯合二倍性的愈伤组织或胚状 体(图—3E)。 上述离体培养的小孢子发育的几种方式是最常 见的。 在某一具体植物的花药或花粉培养中,可能出 现一种或两种以上的不同发育方式。 第三节 花粉培养 花粉培养是指把花粉从花药中分离出来,以单个花粉粒作为 外植体进行离体培养的技术。 1、花粉培养的优点:(主要有4点) (1)花粉(多采用单核中、晚期)本身已是单倍体细胞,因 此,诱导它经愈伤组织或胚状体发育成的小植株均为单倍体植 株,不会因药壁、花丝、药隔等体细胞组织的干扰而形成体细 胞植株。 (2)能直接从单细胞开始观察整个雄核发育进程。 (3)由于花粉是真正的单细胞单倍体,因此,其群体能匀质 地接受各种化学和(或)物理的因子处理,是诱导突变和转化 的有用材料。 (4)花粉能直接发育成胚,对研究雄核发育的生理生化等问 题提供了方便。 第三节 花粉培养 缺点:是技术难度大,迄今除茄科的一 些植物种外,许多重要作物的花粉培养至今 未获成功,尤其是在禾本科中只有水稻由游 离花粉培养获得绿色再生植株。但随着科学 的发展,技术和设备的改进,将会取得不断 成功和应用。 第三节 花粉培养 2、花粉培养技术 花粉培养技术由花粉分离和花粉培养两个基本程序 组成。 (1)花粉分离 花粉分离方法有自然散落法和机械挤压法两种。 ①自然散落法(P227) 即先接种花药,当花药自动裂开时,花粉散落在培 养基上,移走花药。如用液培,1~2天后,花粉散落 后用200目滤网过滤,再接种培养。 ②机械挤压法(P227) 在有液体培养基的玻璃瓶内,用玻棒轻轻挤压花药, 使花粉逸出,再用200目过滤网除去药壁等体细胞组织, 得到花粉进行接种培养。 第三节 花粉培养 (2)花粉培养 花粉培养方法主要有以下5种: ①平板培养法:谷明光等(1977),即,琼脂包理法 将等量的花粉悬浮液与温度达45℃左右的含1.2% 琼脂的液状培养基混合,混匀后倒入培养皿中制成平板 进行培养。水稻花粉经培养38~48天后形成愈伤组织, 烟草花粉培养两个月后形成球形胚。 ②看护培养法(P228) Sharp等(1972)用此法培养番茄花粉获得单倍 体愈伤组织。 第三节 花粉培养 ③微室悬滴培养法(P229) 用含若干花粉粒的液体培养基作成悬滴。 ④条件培养法: 在合成培养基中加入失活的花药提取物, 再接入花粉进行培养。 ⑤预培养法 在多数花粉培养成功的实例都是来自经花 药预培养后的花粉。 第四节 花药培养 第四节 花药培养 鉴于花粉培养技术难度较大,目前由游离花 粉培养获得单倍体植株的成功例子太少,而通 过花药培养获得单倍体植株者却相当普遍,因 为花药培养同样可以获得和游离花粉培养那样 所得到的单倍体花粉植株,而且手续大大简化, 不需要进行游离花粉的处理程序,也不需要特 殊的培养装置,所以花药培养是应用最为广泛 的一种方法。 第四节 花药培养 花药培养技术主要包括以下几个环节: 1、材料选择: 2、材料预处理: 3、材料灭菌: 4、花药接种: 5、脱分化培养: 6、再分化培养: 7、花粉植株移栽: 8、染色体加倍: 第四节 花药培养 1、材料选择: 从几个方面考虑: (1)材料基因型: 不同种的植物,对花药(粉)培养的诱导反应 极为不同。实验证明,供体植株的遗传背景对花药 培养成败关系甚大。例如:水稻中,粳稻比籼稻容 易培养,花粉愈伤组织诱导率,前者一般平均可达 10%,后者只有1~2%。不同品种间也有差异, 对水稻而言,花药培养力(愈伤组织诱导率和绿苗 分化率)的大小顺序为:糯型>(粳×籼)杂种> 粳型>籼型杂交稻>籼型。(李梅芳,1991)。 小麦、烟草不同品种也有高有低。 第四节 花药培养 (2)材料生理状态 花药供体植株的生理状态,对花粉愈伤组织的诱导 率有直接影响。 对水稻、小麦和大麦等禾本科植物而言,大田植株 比温室植株、主茎穗比分蘖穗花粉愈伤组织的诱导率都 明显的要高。不同季节接种的花药愈伤组织诱导率也有 显著变化,例如:水稻,早造比晚造接种的愈伤组织诱 导率要高;烟草,开花早期比开花晚期的花药可产生更 多的花粉植株;小麦,早期接种比晚期接种的材料愈伤 组织诱导率可提高2~3倍。说明供体植株的生态环境, 特别是温度和光周期可能对花粉发育及其对离体培养的 反应有重要影响。 第四节 花药培养 (3)花粉发育时期 接种花药的花粉发育时期,是决定花药培养能否成 功的关键因素。花药培养研究中早已发现,只有培养花 粉发育到一定时期的花药,对外来刺激才最敏感,且易 诱导产生愈伤组织或胚状体。不同植物的花粉对外来刺 激的敏感时期是不同的。例如:水稻、烟草的花粉,从 单核中期到双核期均可接受诱导,而小麦、玉米等花粉 则以单核中期为佳,番茄、大麦则还要更早些。木本植 物如柑桔、杨树、苹果、三叶橡胶及枸杞等均以接种单 核期花药为宜。总的来看,大多数植物在单核期特别是 单核中后期比较敏感。因此,可以此时期的花药作为主 要接种材料。 第四节 花药培养 如何选择确定花粉发育时期,可从两个方面: 一是从植株有关器官的外部形态来选择。 因为花粉发育时期与植株有关器官的外部形态 有直接联系。如水稻在剑叶与下一叶的叶枕距5~ 8厘米、花药为颖壳长的1/2,淡黄色,此时花粉 母细胞基本为单核靠边期:烟草此时的花蕾的花冠 大约与萼片等长,等等。据此可在田间初选材料, 即把符合要求的穗子或花蕾取回。 二是进行镜检确定 对从田间选取的材料用“醋酸洋红压片法”进行 镜检,以确定花粉的发育时期。 第四节 花药培养 2、材料预处理 对所取用的穗子或花蕾,进行低温、激素(生长 素)或其他方法预处理,能有效提高愈伤组织诱导 率和苗分化率。 (1)低温预处理: 一般是将材料置于冰箱5~10℃下冷藏一定时 间再接种。处理时间视不同植物而定,水稻在5~ 10℃时为5~8天,烟草在7~9℃时为7~14天。 同种植物不同品种的要求也有差异,需作试验比较 才能确定。 第四节 花药培养 (2)激素(生长素)预处理 对母体植株或取回的穗子、花蕾预先用一 定浓度的2.4—D、NAA等生长素喷洒,到 一定时间后再取其花药接种。这对提高愈伤 组织诱导和苗分化的频率也有一定效果。 (3)糖的预处理: 高糖浓度→适宜糖浓度。 对提高一些植物的花药培养效果明显。 第四节 花药培养 3、材料灭菌: 取回的材料,在接种前必须进行表面灭菌。一 般方法是先用70~75%酒精擦洗穗子和花蕾的外 部苞叶,然后用0.1%升汞浸泡7~10分钟(水稻、 玉米等需剥取穗子浸入消毒液)或用饱和漂白粉溶 液浸泡10~20分钟以灭菌,最后用无菌水冲洗3~ 5次,供接种用。 材料灭菌是花药培养成功与否的一个重要环节, 此关不过,谈不上什么培养。 第四节 花药培养 4、花药接种: 在无菌条件下(超净工作台上),把花药从小穗 或花蕾中取出,接入固体或液体培养基。接种方法 因不同植物而异。如水稻,可用“剪颖抖药法”, 即先将小穗在颖壳2/3处剪下(内含花药),然后 用镊子夹取带花药的颖壳,剪口朝下在试管口或三 角瓶口敲打,使花药抖落在培养基表面。又如玉米, 可用“去颖夹药法”,即用手捏住小穗颖壳上部, 持镊子将花药基部的颖壳夹去掉,挤出花药敲接入 培养基表面。一般每管或每瓶接种花药30~50个。 第四节 花药培养 5、脱分化培养: 脱分化培养主要是为诱导花药(花粉)产生愈伤组织。 诱导培养基视不同植物需要可采用不同基本培养基和激 素配比。 如水稻,一般用N6作基本培养基,附加 2.4—D2~3mg/l+KT1~2mg/l+水解乳蛋白(LH) 500mg/l+蔗糖(S)30g/l+琼脂 (Ag)4g/l, pH=5.8。 花药接入诱导培养基后,一般置于黑暗条件,25~ 28℃下培养以诱导愈伤组织。 第四节 花药培养 6、再分化培养: 再分化培养主要是使花药(花粉)愈伤组织分化产 生根、芽,再生成完整植株。不同植物对再分化的培养 基及激素配比的要求也有所不同。一般可用MS为基本 培养基,对水稻分化而言,可附加KT2~ 3mg/l+NAA0.5~1mg/l+IAA0.5~1mg/l+水解乳 蛋白(LH)500mg/l+蔗糖(S)25g/l+琼脂(Ag) mg/l,pH=5.8。 再分化培养一般需在光照1500Lux以上,25℃左右 下进行。对再分化要求苗分化率高,根芽协调,苗正常 健壮,根生长良好。故有时需作生根壮苗培养。 第四节 花药培养 7、花粉植株移栽: 当花粉植株生长至一定标准,应及时进 行“炼苗”并移至苗床或营养钵中,细心管 理使其生长健壮,然后移至大田栽种、管理、 观测和选育。 第四节 花药培养 8、染色体加倍: 花粉植株因来自单倍体细胞,故大多数为单倍体植 株,一般占60~70%,需加倍成为纯合二倍体才能直 接利用。 一般有2条途径:一是利用单倍体自然加倍,即在培 养过程中通过细胞本身发生的核内有丝分裂,使染色体 加倍,进而分化出纯合二倍体植株,不同植物的自然加 倍率也不同,如水稻可达30%以上。二是利用秋水仙 碱进行处理,如在花药培养时加入50~250mg/l或对 单倍体苗生长点用0.04~0.2%秋水仙碱浓液浸泡2~ 3天或对单倍体组织、器官(如幼穗)切块离体培养并 用0.02%秋水仙碱溶液浸泡愈伤组织24小时再分化植 株,其他还有采用秋水仙碱溶液注射法、浸根法等。 第四节 花药培养 花粉单倍体植物的培养程序 花粉单倍体植物的培养共分五个程序:即 (1)材料准备;(2)诱导花粉脱分化形成 愈伤组织或胚状体;(3)愈伤组织的植株 分化或胚状体的正常生长;(4)完整植物 体的形成;(5)再生植株的驯化和移植。 各程序及其技术关键列入下图: 花粉单倍体植物的培养程序及其技术关键。 第五节 花药(花粉)培养中白化苗产生 的机理及影响因素 在禾谷类作物,尤其是大麦、水稻花药—— 花粉培养中,常遇到再生植株是白化苗,个别 材料平均白化苗率高达70%至80%,这就严 重限制了花药、花粉培养技术在遗传和育种实 践中的应用。研究白化苗的成因进而控制其发 生是当前禾谷类单倍体育种工作中急待解决的 问题。近年来在这一领域有不少有意义的研究 结果,但迄今对白化苗的成因还没有比较令人 信服的解释。 第五节 花药(花粉)培养中白化苗产生 的机理及影响因素 一、影响白化苗形成的因素 1、基因型 在花粉植株中,白苗所占比例与接种材料的基因型有关。例如 在水稻上,一般籼亚种、籼/粳杂种白苗产生频率较高,有的材料 高达90%以上。因为籼稻或粳稻,不同品种的白苗产生频率也有 很大差异。又如,在大麦花药培养中,比较了17种不同基因型材 料,其白苗分化频率为3.23%~33.33%,差异十分明显。 2、培养基 大量试验表明,培养基对花粉愈伤组织分化绿苗或白苗的影响, 主要发生在愈伤组织形成阶段,即受诱导培养基的影响较大,而 受分化培养基影响较小。在诱导培养基的各种成分中,对白苗分 化率影响最大的是激素的种类及水平。 第六节 花药(花粉)培养及单倍体育种 的应用 在植物组织培养中,花药(花粉)培养及单倍体育种 的应用是广泛而又独特的。从花粉植株中不但可获得大 量单倍体和纯合二倍体植侏,还可获得异倍体、非整倍 体、混倍体和染色体结构变异的植株。因此,花药培养 为植物染色体工程开创了新的途径。 大量单倍植株是创造各种非整倍体的原材料,又是快 速获得遗传纯系的捷径,从而可以缩短杂交育种年限, 加快育种进程。 单倍体植株还是遗传学和细胞学研究的一种理想实验 材料,是了解物种系统发育的很有意义的资料。 花药培养及由此而兴起的单倍体育种在植物改良上更 具有广泛的应用前景。 第六节 花药(花粉)培养及单倍体育种 的应用 一、花药培养及单倍体育种在植物改良中应用的意义 (优越性) 1、克服杂种分离,缩短育种年限。 2、排除显、隐性基因干扰,提高选择效率。 3、加速异花授粉植物纯系的获得。 4、提高突变育种效率。 5、获得异源附加系、代换系和易位系。 6、超雄植株的获得。 7、用于物种形成的研究。 8、对栽培品种进行纯化。 第六节 花药(花粉)培养及单倍体育种 的应用 1、克服杂种分离,缩短育种年限。 利用常规育种法,得到一个稳定的品系一般 约需5~7年,单倍体育种法仅需2年。以自花 授粉作物为例,杂交后在第二代(F2)开始分 离,一般要到F5、F6才能稳定,有些亲缘远的、 配组复杂的还要10代以后才能稳定。而从F1花 药培养得到的花粉植株一代(H1),即可得到 稳定的纯合二倍体。比常规法至少缩短3~4个 世代。 第六节 花药(花粉)培养及单倍体育种 的应用 2、排除显、隐性基因干扰,提高选择效率。 利用单倍体育种,可以排除显、隐性基因干扰, 提高选择效率。 单倍体育种法比常规杂交育种法的选择效率在理 论可提高2 n倍(n为涉及的等位基因数目)。 假设:一个杂交组合的双亲,为一对等位基因的 差别、两对等位基因差别、n对等位基因差别时, 常规育种和单倍体育种选择效率比较如下: 第六节 花药(花粉)培养及单倍体育种 的应用 上例所选择的特定基因是双隐性(aabb)。如 果将选择的特定基因为双显性(AABB),那么两 者的选择效率相差会更大。 根据孟德尔分离定律。具有A—B—-基因型的个 体,占9/16;具有A—b—;a—B—两种基因型个 体各占3/16。 常规育种中由于显性基因的干扰,想获得双显性 基因型的个体就需要花更长的时间。如果利用单倍 体育种,双显性个体和双隐性个体出现概率相等, 选择概率也相等,选择效率自然也就提高许多。 第六节 花药(花粉)培养及单倍体育种 的应用 3、加速异花授粉植物纯系的获得。 采用花药培养得到的花粉植株经过染色体 加倍即成为纯系(只要1代)。而异花授粉 植物通常要经人工自交6代以上才能得到纯 系。 第六节 花药(花粉)培养及单倍体育种 的应用 4、提高突变育种效率。 用辐射或化学等法进行诱变育种,通常只能得到百 万分之几的诱变率。由于在诱变过程很难使等位基因的 两个成员同时发生变异,而单个的隐性基因的突变往往 被显性基因掩盖,在处理当代(M0)表现不出来。 为使这些隐性变异不致被淘汰,处理当代(M0)的 种子要全部收下,连续播种,工作量大,尽管如此,也 有许多有用的突变基因被显性基因掩盖而被淘汰。 如果用单倍性细胞或植株进行诱变处理,由于只有一 套染色体。在性状上不存在显性掩盖隐性,使单个基因 突变能力能直接表现出来,可大大加速获得突变体的速 度。 第六节 花药(花粉)培养及单倍体育种 的应用 5、获得异源附加系、代换系和易位系。 远缘杂交后进行回交、再对杂种花药进行离 体培养,在花粉加倍单倍体植株中可获得异源 附加系、代换系和易位系等各种重组体,使有 用的异源基因或染色体片断或整条染色体转移 到栽培作物上。 6、超雄植株的获得。 用雌雄异株植物(如石刁柏)的花药离体培 养,则可得到超雄植株。 第六节 花药(花粉)培养及单倍体育种 的应用 7、用于物种形成的研究。 培养未经染色体加倍的异源多倍体花粉植株的花药, 有可能得到合成这种异源多倍体的亲本植物。 8、对栽培品种进行纯化。 优良品种育成推广后,经几年或十几年栽培,由于 生物学混杂丧失原有品种的优良性状。表现为种性混杂 品质变劣,产量大幅度下降,失去经济价值。 如若对基因型混杂的品种进行花药或花粉培养,可 以获得不同配子类型的花粉植株。通过人工染色体加倍 成为具有不同基因型的纯合二倍体,然后再对其及后代 进行田间遗传分析,选择具有原品种优良特性、特征的 植株,大量繁殖推广,而达到提纯复壮的目的。 第六节 花药(花粉)培养及单倍育种的 应用 第六节 花药(花粉)培养及单倍育种的 应用

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