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第五章 花药和花粉培养1

  植物组织培养本章主要内容: 花粉和花药培养的应用花粉和花药的培养(pollen antherculture) 是指在人工合成培养基上,改变花粉的发育途径, 使其不形成配子,而像体细胞一样进行分裂\分化, 由单个花粉粒发育成完整单倍体植株的技术。 花药和花粉培养单倍体植物(haplobiont) 用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的 植株。花药培养、花粉培养;胚珠或子房培养(未受精) 相同点:二者培养的目的一样,都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞,最后发育成单倍体植株。 不同点:花药培养属器官培养,花药是植物花的雄性器官,包括体细胞性质的药 壁和药隔组织,以及雄性性细胞的花粉粒 花粉培养属细胞培养: 花粉培养没有药壁组织干扰; 可计数小孢子产胚率; 可观察雄核发育的全过程; 单倍体产量高。 但技术更复杂,比花药培养难度大。 二、植物花药/花粉培养历史 Guha和Maheshwari(1964)曼陀罗花药培养 Nitsch和Norreel (1973) 烟草花粉培养(游离小孢子培养) Chu(1973)小麦花粉培养 (早期花药培养主要依靠小孢子的自然胚胎发生产生单倍体,能自 发形成胚胎发生的基因频率较低,效率极低) 80年代后期到90年代期间,花培技术迅速发展。许多作物小孢子培养已经成功。十字花科、麦类、水稻、玉米等。 90年代,一些先前被认为是不易进行小孢子培养的基因型也相续成功Konzak (1999) 通过花药 培养 育成 花药和花粉培养供体植株 小孢子(n) 雄核发育自然加倍 人工加倍 纯合植株DH (2n) 一年内获得纯系 常规育种需4-6年获得纯系,而小孢子培养仅需一年。 1、作物育种 常规育种在杂交F5、F6代开始选择;花药 培养在F1或F2代进行培养,再人工加倍处 理.缩短育种周期3--5年 克服后代分离,大大缩短育种周期 第二节花药和花粉培养的应用 花粉单倍体是纯合配子体,从来源于配子体的 植株中选择某一种基因型的概率是(1/2) 从常规杂交F2代群体中,选择某一基因型的概率为(1/2) 2n ,故单倍体育种的选择效率为常 规育种的2n倍。 提高目标基因型的选择效率提高目标基因型的选择效率 例子: 二倍体供体植株基因型为AaBb,若要从后代中选择基因为AAbb 的纯合单株 常规方法: AAbb出现的概率为1/16,并且不能将AAbb与Aabb、 aAbb区分开。 AB aB Ab ab AB AABB AaBB AABb AaBb aB aABB aaBB aABb aaBb Ab AabB AabB AAbb Aabb ab aAbB aabB aAbb aabb 例子: 二倍体供体植株基因型为AaBb,若要从后代中选择基 因为AAbb的纯合单株 单倍体方法:AAbb出现的概率为1/4。 单倍体 二倍体 AB------ AABBaB----------------------------

  aaBB Ab----------------------------

  AAbb ab-- aabb供体亲本 AaBb 从来源于配子体的植株中选择某一种基因型的概率是(1/2) ,而从常规杂交F2代群体中,选择某一基因型的概率为(1/2) 2n ,故单倍体育种的选择效率为常规育种的2n倍。 植株不受显隐性的影响,在诱变育种中能在当代及时获得突变个体,染色体加倍后成为稳定的纯系。 可探索亲本染色体组的构成。分析单倍体植 物减数分裂时,形成二价体的数目和形状,能确 定染色体组内是否存在同源染色体。 单倍体植株中基因不受显隐性的影响,每一个基因的作用均能表现出来。能用来研究基因的性质 及其作用。还可用于基因的剂量效应分析。 双单倍体(DH)群体是永久性群体,能有效地用于遗传图谱的构建。 概念:花粉孢子体发育途径(雄核发育途径)花粉是产生花粉植株的原始细胞,其第一次有丝 分裂,在本质上与合子的第一次孢子体分裂相似,把 花粉形成植株的途径称为花粉孢子体发育途径,也叫 雄核发育途径 一、花粉发育的阶段 花粉离体培养时,雄核发 育最适宜的时期一般是第 一次有分裂或之前。 二、雄核发育途径 1、A途径 小孢子第一次有丝分裂为非均等分裂,形成营养 细胞和生殖细胞 (1)A-V途径 由营养细胞重复分裂形成单倍体 (2)A-G途径 由生殖细胞重复分裂形成单倍体 (3)A-VG途径(E途径) 由营养细胞和生殖细胞各自独 立分裂,共同形成单倍体 (4)C途径 营养细胞和生殖细胞通过核融合,形成多倍 体植株 2、B途径 小孢子第一次有丝分裂为均等分裂,形成大小相 近的两个细胞。然后由这两细胞边续分裂形成单倍体植株, 或者核融合形成多倍体植株 1、雄核发育与P花粉的形成 P-花粉:具胚胎发生潜能的花粉。也称小花粉(S-花粉)或不染 色花粉(NS-花粉) 2、雄核发育与饥饿处理 饥饿处理改变了小孢子的配子体发育方向,启动雄核发育。 三、雄核发育启动机理 1、胚状体发育途径 小孢子经历胚发生的各个阶段,最后子叶展开,形成花粉植株。 2、愈伤组织发育途径 小孢子分裂数次形成愈伤,再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会 出现变异且倍性复杂。 四、花粉植株形态发生方式 胚状体发育途径 部分花药通过胚状体途径形成小植株 烟草花药培养 通过胚状体途径再生形成小植株 烟草花药培养 胚状体发育途径 鱼雷形胚芸苔属小孢子培养 愈伤组织发育途径 部分花药产生愈伤组织 接种在平板上的水稻花药 水稻花药培养 愈伤组织转接种到再生培养基 愈伤组织分化形成再生植株 水稻花药培养 四、影响雄核发育和花粉花药培养的因素一、花药培养 1、取材镜检,根据花粉的发育时期,选取大小适宜的 花蕾。 2、消毒70%酒精擦洗花蕾表面,或70%酒精浸泡30- 60s后在1%次氯酸钠溶液中浸泡10-20min或在0.1%的氯 化汞溶液中消毒3-10min,无菌水冲洗3-5次。 3、培养固体或液体培养基均可。先进行脱分化培养, 至小孢子大量分裂形成胚或愈伤,并突破花药壁表面,形 成突出物(2-3周);后转入分化培养基培养,形成小植 1、自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法)将花药接种在预处理液或液体培养基上,待花粉 自动散落后,收集培养。 2、挤压法在烧杯或研钵中挤压花药,将花粉挤出后收集培养。 1)磁搅拌法 用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药,使花粉游离出来; 2)超速旋切法 通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药,使 小孢子游离出来(此法应用最广)。 4、小孢子纯化对上述方法获得的小孢子混合 物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子 3、机械游离 梯度离心前 (小孢子形态、活力不一致) 30%蔗糖梯度离心后 (获得均一的小孢子群体) 1、平板培养花粉置琼脂固化培养基上培养。 2、液体培养花粉悬浮在液体培养基中培养,需震荡,以利通气。 3、双层培养花粉置固体-液体双层培养基上培养。 培养基制作方法:先铺一层琼脂固体培养基,凝固后,在表面加入少量液 体培养基。 利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞,并使 其生长和增殖。这个愈伤组织块称为看护愈伤组织1)在一个培养瓶中加入一定量厚 的固体培养基,灭菌后备用。 2)在无菌条件下,将一小块 (1cm )活跃生长的愈伤组织接种到培养基上,再在愈伤组 织块上放一片(1cm)已灭菌 的滤纸,放置过夜。 3)将分离的花粉接种到已经充分 吸收愈伤组织渗透液的滤纸上。 4)单细胞分裂形成肉眼可见的小 细胞团后,即转移到新鲜培养 基上培养,恒温培养,得到单 细胞无性系。 具体方法 5、微室培养利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养。 6、条件培养基培养利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的 培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等。 1滴含单细胞培养液 周围加石蜡油 旁边各加石蜡油 盖盖玻片 盖盖玻片 平视图 凹穴载玻片 置培养皿中26~28 温培养取花蕾(镜检) 预培养数天 取花药 消毒 分离花粉 第一节花药和花粉培养技术 接种 培养 愈伤组织发生 三、白化苗现象 (一)白化苗产生的影响因素及机理 1、内因 供体植株基因型(如籼稻比粳稻白苗率高)、 花粉发育时期。 2、外因 预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养 条件和方法、愈伤组织转分化时间等。 3、机理 核基因起关键作用,导致质体DNA缺失,产生 白苗。另外地、无性系变异也可能是原因之一。 (二)白化苗的控制 通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行调控。 四、影响雄核发育和花粉花药培养的因素 (一)基因型植物基因型是影响雄核发育的最重要的因素之一。 同一物种中的不同基因型对小孢子离体诱导反应差异 较大。 如在水稻中,籼稻花粉培养力远低于糯稻。 小孢子发育时期对诱导雄核发育非常重要。 (三)花粉发育时期 适宜时期:单核期,尤其是单核中、晚期 (单核靠边期) 芸苔属植物Brassica napus不同基因型的小孢子产 胚率比较 Topas 10,000-200,000 1-20 Westar 1000-10,000 0.1-1 Delta 100-10,000 0.01-1 Bounty 10-100 0.001-0.01 基因型 胚状体数量/106小孢子 1、植株生长条件光温等因素均能影响花药培养力。一般 处于适宜生长条件(如温室中)较好。但物种间存在差异。 2、植株生长时期 一般是开花始期优于开花末期。 3、P花粉的频率 不同温度、日照时数、氮饥饿及生长物 质处理提高P花粉的数量 (二)供体植株生长条件和生理状态 随着细胞体积迅速增大,细胞核由中央位置推向一边,即单核靠边期。。 雄配子体的发育 营养细胞 生殖细胞 精子 四分体: 醋酸洋红染色 四分体: Alexander’s 染色 单核期 成熟花粉粒处于不同发育时期的烟草小孢子 单核晚期 液泡 第一次有丝分裂后期 双核早期 双核中期 生殖核 生殖核 营养核 一般而言,单核期(第一次 有丝分裂前)对诱导反应最 敏感,为最佳培养期。 形成双核后,在合适的条件 ,主要由营养细胞分裂产生 不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期发育时期 物种 减数分裂期 草莓、番茄 四分孢子期 葡萄 单核早中期 石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯 单核晚期 荔枝、茄子、青椒、小麦 单核早期至晚期 烟草 单核早期至双核期 梨、水稻、甘蓝 四分孢子期至双核 对不同发育阶段的花药进行培养测试 确定最佳小孢子发育时期的形态特征 注意形态特征会因品种、发育状态、环境条件的 变化而发生变化 处于不同发育阶段的烟草花芽 花粉发育时期的确定 根据细胞观察推测,双核期的花粉中开始积累淀粉,不能使花粉发育成植株。通常采用 醋酸洋红或碘化钾染色,再压片镜检,以确定 花粉的发育时期。 但是接种前不可能把所有的花粉都进行一次发育时期的镜检,通常是按照花蕾长度大小 与花粉发育年龄的相关性,实际操作中取一定 大小的花蕾进行的。 A.通过显微镜下观察确定小孢子发育时期 醋酸洋红染色 DAPI 染色 B.通过花蕾外部特征确定小孢子发育时期 花蕾的外部形态特征与小孢子的发育时期有一定 的相关性,花蕾萼裂基部与花冠顶部之差可以作为判 断小孢子发育时期的基本指标。 预处理是小孢子培养成功的前提条件 预处理目的:是改变小孢子的发育方向,使尽可能多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径(即成为具 胚胎发生潜力的小孢子)。适当的预处理能使绿苗产量大 量增加。 预处理方法:主要是对花药进行适度的逆境处理,包括低温、高温、化学物质、离心、射线、高低温处理 低温冷藏是最常用的方法 从健壮无病植株采集花蕾,将花蕾用湿纱布包裹放入塑料袋中, 置冰箱冷藏。低温处理可阻止小孢子正常分化,使停留于单核状态的花 粉显著增多,有利于诱导分化愈伤组织和胚状体。 例子: 十字花科未经低温预处理的花蕾,每花药产胚数为4.39个,6- 9处理1天,产胚数提高到61.4个,预处理4天后,胚状体产量降为 10.47个。 预处理方法: 高温处理(热击处理): 指花药接种后,先在较高温度下(30-35)培养数天,然后再移 至正常温度下继续培养。 例子:如烟草,32高温;小麦,33高温预处理显著地提高了小 孢子胚胎发生能力(Touraev,1996) 2、化学物质处理 包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等进行处理。甘露醇仅能维持渗透压,不能提供碳源,其主要原理是造成小孢子营养饥饿, 从而使小孢子去分化。 3、其它 包括γ射线、离心、磁场等。(五)培养基 1.基本培养基 主要为N6和MS培养基。 MS和H培养基:适合双子叶植物花药培养; B5培养基:适合豆科和十字花科花药培养; N6培养基:适合禾谷类作物的花药培养。 Nitsch培养基:适合芸薹属和曼陀罗属。 高浓度的NH4 显著抑制花粉愈伤组织形成。铁盐对花粉胚状体发育很重要。活性炭促进胚状体发育。 包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。 不同作物所需最适的碳源种类及浓度的所差异。 在辣椒花药培养中以6%的蔗糖浓度对胚状体的诱导率为最高。 在番茄花药培养中需要量高达 在番茄花药培养中需要量高达14 14%。 其原因是花粉母细胞的渗透压比花丝等体细胞高的缘故,即高浓度的蔗糖其原因是花粉母细胞的渗透压比花丝等体细胞高的缘故,即高浓度的蔗糖 不利于药壁、花丝等体细胞的生长,而利于花粉的生长。 不利于药壁、花丝等体细胞的生长,而利于花粉的生长。 一般认为单子叶植物比双子叶植物需糖的浓度要高。 玉米中蔗糖效果最好;而麦类作物中,麦芽糖似乎为最好的碳源。 较高浓度蔗糖可诱导花粉形成愈伤组织; 较低浓度蔗糖可使愈伤组织分化成苗。 2.碳源 3、激素 细胞分裂素可促进胚状体形成; 生长素可诱导愈伤组织形成。 细胞分裂素与生长素比值高时可诱导愈伤组织分化苗 4、氨基酸 5、活性碳 6、pH (六)培养条件 1、温度 物种间有差异,培养温度在25~28左右 2、光照 光暗交替培养,每天12~18h的光照,光照强度 2000~10000lx。 3、植板密度 植板密度与花培效率有很大的相关性。510 ml密度均能有效培养。一般来说,足够数量的、但相对低密度的小孢子浓度有利于小孢子竞争营养、氧气、细胞分裂的空 间,从则有利于胚状体发生。 花药组织的存在对小孢子的胚性分裂具有明显的促进作用。 但花药壁损伤会释放有毒物质影响小雄核的发育。 (七)花药壁因素 一、倍性鉴定 二、染色体加倍 一、倍性鉴定 (为什么要进行倍性鉴定?) 1、染色体直接计数法 通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片,直接计数染色体数目。 2、间接鉴定 (1)扫描细胞光度仪鉴定(流式细胞仪) 主要测定叶片单个细胞中 DNA的含量确定细胞的倍性,材料的使用量可少到1cm2。 (2)细胞形态学鉴定法 叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保 卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。 (3)植株形态学鉴定法 单倍体植株瘦弱,叶片窄小,花小柱头长,花 粉粒小,不结实。 (4)杂交鉴定法 自交或测交鉴定,看后代分离情 况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。 (5)分子标记鉴定 包括生化标记(如同工酶标记) 和分子标记(如RFLP、RAPD、AFLP等) 二、染色体加倍 (为什么要进行加倍?) 1.自然加倍: 花粉细胞核有丝分裂或核融合可自然加倍,其优点是不会 出现畸形,缺点是随机性强,难以掌握和利用。 2.人工加倍:用秋水仙素溶液浸苗、处理愈伤组织和用含0.4%秋水仙素 的羊毛脂涂抹单倍体植株的顶芽、腋芽,可得到能结实的二倍体植株。 3.愈伤组织反复继代培养,可得到二倍体植株。 将单倍体植株(孢子体)的茎段、叶柄、根茎切下,置适宜的培养 基上使之发生愈伤组织,反复继代后再将愈伤组织转移到分化培养基上, 即可获得较多二倍体植株。由于单倍体愈伤组织在培养过程中会有一定 高频率的核内有丝分裂,从而形成二倍体细胞,分化出纯合的二倍体植 单倍体植物天然发生的途径:孤雌生殖 孤雄生殖 无配子生殖 也称单性生殖,即卵不经过受精也能 发育成正常的新个体 配子体可以不经过配子的结合,而 直接产生孢子体的,这种现象叫做 无配子生殖 花药和花粉培养基本流程: 预处理花药(物理或生理逆境) 收集具胚性小孢子的花药,或离心收集胚性小孢子 培养(充足的营养、合适的温光、或条件培养)形成胚状体 胚状体转移至固化培养基上”萌发”形成小植株。 选择合适的供体植株(F1?) 倍性鉴定或染色体加倍 1974年日本:花药培养可以脱除草莓病毒; 花药采取时期 单核期:花蕾4-6mm,花药1mm 花药诱导愈伤组织培养基 MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L 增殖分化培养基 MS+GA1mg/L+IBA0.2mg/L+BA1mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L 生根培养基 1/2MS+IBA0.2mg/L+活性炭3g/L+蔗糖20g+琼脂7g/L 第一节花药和花粉培养技术 草莓花药愈伤组织,再生植株,花药植株 第一节花药和花粉培养技术 孢子有大小两型,其大形者称为大孢子 胚囊细胞embryo-sac cell 是种子植物的大孢子,是由胚囊母 细胞减数分裂形成的单倍的细胞,相当于苔藓植物和蕨类植物的 大孢子 被子植物和裸子植物花药内的花粉四分体也称为小 孢子. 孢子是生物所产生的一种有繁殖或休眠作用的细胞,能直接 发育成新个体。孢子一般微小,单细胞。 由于它的性状不同,发生过程和结构的差异而有种种名称。 生物通过无性生殖产生的孢子叫“无性孢子”,如分生孢子、孢 囊孢子、游动孢子等; 通过有性生殖产生的孢子叫“有性孢子”,如接合孢子、卵 孢子、子囊孢子、担孢子等; 直接由营养细胞通过细胞壁加厚和积贮养料而能抵抗不良环 境条件的孢子叫“厚垣孢子”、“休眠孢子”等。 (1)花药培养是器官培养,花粉培养属细胞培养。 (2)花药培养一般选择花粉的单核期进行接种。 (3)花药培养包括:选择材料-消毒-接种培养-愈合组织 生成-分化出单倍体植株。 (4)花粉的发育途径包括:营养细胞发育、生殖细胞发 育、营养和生殖细胞同时发育及花粉均等分裂发育。 (5)花粉培养包括花粉的分离-预处理-培养过程。 花药和花粉培养1、花药培养的意义。 2、花药培养方法。 3、花药培养和花粉培养有何区别? 4、花药培养时选择什么发育时期的花药?为什么? 5、花药培养时培养基配制有什么特点?

  第五章 花药和花粉培养1一,花药,第五章,第5章,花粉和,第5 章,花药培养,培养第五章,花粉花药,蓝花药

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