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第章花药和花粉培养(精)

  第7章 花药和花粉培养 花药和花粉培养都是指花粉在培养基上改变其正常发育和机能, 不经受精发生细胞分裂, 由单个花粉粒发育成完整植株的技术。 花粉粒的发育过程: 减数分裂 花粉母细胞─── →四分体→花粉粒(单核,n) (单核期) (2n) (n) ↙ ↘ 生殖细胞(n) 营养细胞(n) (双核期, 二核花粉粒) ↙↘ 精子...

  第7章 花药和花粉培养 花药和花粉培养都是指花粉在培养基上改变其正常发育和机能, 不经受精发生细胞分裂, 由单个花粉粒发育成完整植株的技术。 花粉粒的发育过程: 减数分裂 花粉母细胞─── 四分体花粉粒(单核,n) (单核期) (2n) (n) ↙ ↘ 生殖细胞(n) 营养细胞(n) (双核期, 二核花粉粒) ↙↘ 精子(n) 精子(n) (三核花粉粒) 第1节 花药培养(单雄生殖) 1 花药培养的一般程序 1 ) 采花粉在单核期左右的花蕾或幼穗; 2) 保湿条件下低温等预处理; 3) 取出花药表面消毒; 4)将花药接种到适宜的培养基上, 在适宜温度下培养 (有时需短时预培养); 5) 花粉胚或花粉愈伤组织发育到适当阶段后, 转入植株再生培养基,形成花粉植株; 6) 染色体加倍; 7) 移入土壤栽培。 禾本科植物花粉植株的诱导一般过程: 花药 含有2,4-D (1~2mg/L)的诱导培养基, 蔗糖浓度依植物种类不同而异(2~1 2%) 愈伤组织 1 0~15d,长到直径约1 .5~2.0mm时 分化培养基: 去掉2,4-D,加入(0.2mg/L)NAA和(1mg/L) KT 愈伤组织表面陆续出现绿色芽原基 芽原基萌发,长成绿色的芽 芽分化的同时或稍后,同一块愈伤组织的下部一般会有根的分化. 2 影响花药培养成功的因素 2.1 材料的选择 1 ) 亲本植株的基因型 2) 亲本植株的生理状态 3) 花粉的发育时期 : 多数在单核期较易培养成功。 2.2 预处理 常用低温冷藏,可以提高诱导率.不同材料所需温度和时间不同。 还有离心、 乙烯利、 高温、 甘露醇预处理等。 2.3 材料的表面消毒 常用条件: 1 ) 漂白粉饱和液的上清液浸泡1 0~1 5min; 2) 8~1 0%的安替福民水溶液浸泡5~10min; 3) 0.1 %升汞浸泡1 0min. 2.4 培养基 基本培养基常用: H(烟草) 、 N6(禾谷类) 、 C1 7和W14(小麦) 、B5(油菜) 、 FHG(大麦) 等。 与常规培养基相比:降低铵离子浓度, 调整铵态氮和硝态氮的比例; 有些用麦芽糖等代替蔗糖。 植物生长物质: 不同植物、 不同品种之间都可能有差异。 多数禾本科植物: 外源生长素, 尤其2, 4-D是促进花粉启动分裂、 形成愈伤组织的必要条件。 但细胞分裂素类不是必要条件。 其他: 多种维生素、 氨基酸和其他有机附加物的添加常有利。 有些花药培养中还使用活性炭. 2.5 培养方式 液体培养: 液体培养基比琼脂培养基更适合于花药培养 双层培养 花药-花粉分步培养 条件培养基 2.6 培养条件: 温度: 接种后最初几天在较高温度下培养比较有利。 光: 愈伤组织诱导常以暗培养较好; 分化需要的光照长度和给光时间不同植物要求不同。 3 花粉植株的倍性及染色体加倍技术 3.1 花粉植株的倍性 花粉植株中倍性多样: n,2n,多倍体, 非整倍体 出现二倍体的原因: 主要是核内有丝分裂造成。 和接种花粉的时期、 培养基中激素的种类和水平、 花粉植株的发生方式,以及愈伤组织继代培养时间的长短有关. 3.2 染色体加倍技术 1 ) 利用上述自发的核内有丝分裂; 2) 秋水仙素处理: 浓度范围0.02~0.4%, 处理方式和部位及使用浓度和时间等随植物种类不同而异. 3.3 花粉植株倍性的鉴定 一般是对茎尖或根尖细胞进行染色体计数; 也可用其他指标 4 操作实例:烟草花药培养 选用花粉处于单核晚期(单核靠边期)的花蕾  剥去花蕾萼片, 消毒(70%的酒精1 0 s,饱和漂白粉上清液1 5~30min)  剥去花冠,将花药接种到含有1 %活性碳的H培养基上(+IAA0.1 ~0.5mg/L)  26~28oC,适当照光 3周左右后药室开裂,可见乳黄色的胚状体,见光后很快变绿  胚状体逐渐发育成单倍体小苗 小苗长出3~4片线%的秋水仙碱水溶液浸泡小苗24~48h, 倾出药液,无菌水洗3次)  将小苗分株移栽到T培养基上  小苗长出发达根系时移栽到花盆中(一周内用烧杯将小苗罩起) 第2节 花粉培养(小孢子培养) 将花粉粒从花药中分离出来,进行人工培养, 使花粉粒脱分化,进而发育成完整植株的一种技术. 属单细胞培养 1 花粉培养的特点 1 ) 可以排除花药培养中药壁、 药隔和花丝等体细胞的干扰 2) 便于实验结果的分析. 3) 高效、 节约. 4) 数量多、 单细胞、 单倍性和较高的同步性 2 花粉的分离 2.1 直接挤压 将已消毒的花药在液体培养基中用平头的玻璃棒反复挤压花药,挤出花粉。 2.2 压挤-过筛-清洗(挤压法;机械分离法 ) 从花蕾中分离出花药 加蔗糖溶液或分离液, 轻压花药,挤出花粉. 经合适孔径的细胞筛过滤入离心管 低速离心 花粉粒沉淀 弃上清液; 重新加入蔗糖液,振荡重新悬浮花粉 再次离心,重复3~4次 最后一次用液体培养基代替蔗糖溶液. 上清液吸出后,加入一定量的液体培养基, 血球计数板计数,调整花粉密度, 使达到105个/ml左右. 2.3 散落法(shed pollen method) : 在进行花药的液体漂浮培养时, 花药会自动开裂, 小孢子从花药裂口出散落到培养基中。 及时将花药壁从培养瓶中取出,留下的花粉继续培养(水稻,大麦等) 分离的小孢子可以用密度梯度离心纯化。 3 花粉培养技术 3.1 预处理 与花粉培养类似,低温、 高温等预处理后, 可以提高一些植物小孢子培养的成功率。 3.2 培养基 与花药培养的类似 。 激素含量 小麦小孢子: CHB 培养基(麦芽糖) 3.3 花粉培养的方式 1 ) 直接培养 2) 条件培养 (补充花药提取物) 3) 哺养培养 (nurse culture; 保育培养, 看护培养) 4) 微室培养 3.4 白化苗现象 白化苗产生的原因目前了解尚少 生理的? 遗传的? 4 操作实例 烟草花粉培养 花粉发育时期为单核晚期~双核初期的烟草花蕾3oC处理72h  无菌操作取出花药 接种到 (Nitsch)H培养基  28oC1oC, 光照, 培养3d, 压挤-过筛-清洗的方法分离出花粉,使花粉密度达到7*1 05个/ml  每瓶1 ml分装入20ml的三角瓶  28oC1oC,弱散射光 静止的薄层液体培养.  5~1 0d后 花粉脱分化形成细胞团  20~30d 细胞团发育成胚状体  将子叶形的胚状体转接到H固体培养基上 一周后 胚状体发育成小植株

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