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利用梨花粉单细胞进行基因组单倍型组装的方法

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  1.一种对单个花粉进行单细胞基因组扩增的方法,其特征在于,包括以下步骤:

  (a)培养花粉并制备花粉原生质体:向花粉培养基中加入少量花粉进行花粉培养;然后向花粉培养基中添加细胞裂解液并进行培养破除花粉的细胞壁,采用毛细玻璃吸管获取已经破除细胞壁的单个花粉原生质体细胞;

  (b)扩增及纯化花粉单细胞基因组:将已经破除细胞壁的单个花粉原生质体细胞放入由单细胞全基因组扩增试剂盒提供的细胞裂解液中,采用单细胞全基因组扩增试剂盒进行扩增,然后将扩增产物进行纯化。

  2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(a)中所述花粉培养基的配方为:1.60mM硼酸,1.40mM硫酸镁,0.2mM硝酸钙,292mM蔗糖,25mM MES,pH6.0~6.5;

  步骤(a)中所述细胞裂解液的配方为:35~40%山梨醇,0.4%离析酶R-10,1.0%纤维素酶。

  3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述花粉培养的条件为:花粉培养基中加入少量花粉后轻微震荡,使花粉与培养基充分接触,置于28℃摇床,130~210转/分钟,避光培养40~60分钟。

  4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述细胞裂解液的添加量为:细胞裂解液与花粉培养基的体积比为3:1;向花粉培养基中添加细胞裂解液进行培养的条件为:用移液抢缓慢混匀后于30℃摇床40~100转/分钟,避光培养5~20分钟。

  5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,采用毛细玻璃吸管获取已经破除细胞壁的单个花粉原生质体细胞的过程为:将火焰拉针仪参数设置为加热温度550℃,拉伸速率10,延迟1次,压力值500,拉出尖端孔径大约16微米毛细玻璃吸管;将毛细玻璃吸管安装到显微操纵器上,在显微镜下寻找已经破除细胞壁的花粉原生质体细胞,所选取的花粉原生质体细胞活力好且花粉粒已经接近扁平状态以保证花粉内遗传物质溶出。

  6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(b)中采用单细胞全基因组扩增试剂盒进行扩增的条件为30℃反应8小时,65分钟灭活10分钟;将扩增产物进行纯化的步骤为:

  (1)在每个单细胞全基因组扩增结束后的反应液中分别加入100~150微升Ampure XP珠子;

  (4)将所有混合液体移入EP管中并用磁性分离设备将珠子吸附在管壁上,直至溶液变得完全澄清并且保证溶液中没有悬浮的小珠子;

  (6)保持珠子稳定结合在EP管壁上,分别在每个样本中加入500微升80%的乙醇溶液,然后将乙醇溶液吸出用以除去反应液中的杂质,此步骤重复一次;

  (7)确保EP管内没有任何乙醇残留并室温放置3~5分钟,直至Ampure XP珠子变成半干状态;

  (8)加入超纯水,将EP管从磁性分离设备上移除,并使Ampure XP珠子与超纯水充分混合;

  (9)将EP管继续放置在磁性分离设备上使磁珠吸附在管壁上,静止后收集洗脱溶液得到纯化的扩增产物。

  7.一种利用花粉单细胞单倍体特性对人工染色体进行单倍型分型的方法,其特征在于,对单个花粉进行单细胞全基因组扩增并测序,采用‘12位二进制码’利用花粉单细胞全基因组测序数据对人工染色体进行单倍型分型。

  8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述的花粉为梨花粉,利用12个梨花粉单细胞全基因组测序数据对梨38304条BAC数据进行单倍型分型的过程为:

  第一,每个BAC通过使用SOAPDenovo软件进行独立组装,参数K=27;

  第二,使用bwa将12个单细胞的测序数据比对到每个组装好的BAC序列上,基于SNP位点,通过GATK进行SNP calling;梨的基因组共有17对染色体,因此通过比对信息能够将比对到参考基因组中染色体水平的BAC分成17个组;

  第三,通过统计比对到参考基因组上的BAC的12位二进制位标签将这部分BAC分别归类到两个倍型中,利用12个单细胞的SNP情况将每一个BAC分配到2个倍型中,使用一组12位的二进制标签去代表12个单细胞与BAC之间的关系,通过统计所有12位二进制标签的出现频率以及他们之间的距离关系就能将不同类型的BAC分配到对应的单倍型染色体中,而在参考基因组中没有确定位置关系的BAC序列也能够通过12位二进制标签被分配到相应的单倍型染色体中。

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